生化培養箱在多管發酵法的應用

1．多管發酵法

初發酵實驗  發酵管內裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養液，并在內倒置有小玻璃管。每個樣品用三個不同的水樣量接種，同一接種水樣量要有五管，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養液的發酵管中，在37℃±0.5℃下培養24h±2h。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發酵乳糖，而大腸菌群能發酵乳糖并產酸產氣。培養液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑，細菌產酸后，培養液即由原來的紫色變成黃色。產酸產氣的發酵管表明試驗陽性，如在倒管內產氣不明顯，可輕拍發酵管，有小氣泡升起為陽性。

復發酵實驗  輕微振蕩初發酵試驗陽性結果的發酵管，用3mm接種環將培養物（2-3環）轉接到EC培養液中，在44.5℃±0.5℃下培養24h±2h（提高培養溫度可造成不利于來自自然環境的大腸菌群的生長）。培養后立即觀察，發酵管產氣則證實為糞大腸菌群陽性。

2．濾膜法

濾膜是一種微孔性濾膜，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中，經過抽濾，細菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養基上，在44.5℃±0.5℃下培養24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養基上呈藍色或藍綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養基上很少見到非糞大腸菌菌落。

二．兩種方法的注意事項

1．培養溫度的要求  總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外，在自然環境中的水與土壤中也經常存在，但此等在自然環境中生活的大腸菌群培養的zui合適溫度為25℃左右，如在37℃培養則仍可生長，但如將培養溫度再升高至44．5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細菌，習慣于37℃左右生長，如將培養溫度升高至44．5℃仍可繼續生長。因此，可用提高培養溫度的方法將自然環境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區分，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養基放入生化培養箱時，箱內溫度一定要達到所要求的溫度（44.5±0.5℃）時，方可放入。如用恒溫水浴箱時，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養皿要沉到水浴箱底部。

2．加氯水樣的處理  經氯處理消毒過的水樣，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態，在采集水樣時應提前在采樣瓶中加硫代*，硫代*可以脫氯，使受損的細菌得以復蘇與修復，從而避免出現計數結果偏低甚至假陰性的現象。此外余氯對濾膜法培養的細菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時應對水樣進行大量無菌水稀釋，以減少余氯的殘留。

3．樣品的保存  采樣用的容器使用前應蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當可使樣品中的大腸菌群細菌死亡或在一定條件下再生長，這些都將影響檢測結果的準確性。檢測室接到水樣后，應立即檢測，如因故不能檢測時，應立即將樣品置于冰箱內（2℃-10℃）并于2小時內檢測。

4．培養物質的制備與保存

 ⑴.多管發酵法所使用的培養液在分裝于各發酵管中后，應將發酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min（注意：這個溫度也應控制好，既達到滅菌的作用，還要防止培養物質分解流失），然后貯存于冰箱或暗處備用。

⑵.濾膜法所采用的M-FC培養基多使用外購的成品，培養基中苯胺藍的純度和質量往往影響菌落的顏色，因此，無菌包裝的成套培養基在使用前，先接種典型糞大腸菌，以觀察對比菌落的顏色，來鑒定其穩定性。

5．結果統計 

⑴.多管發酵法的結果是根據不同接種量的發酵管所出現陽性結果的數目，從MPN表中查得相應的MPN指數，來計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指zui大可能數，它是根據統計學理論，估計水體中的菌群密度和衛生質量的一種方法，所以準確判斷不同接種量發酵管的陽性數是非常重要的，否則將導致較大偏差。

⑵.濾膜法的結果是計數濾膜上呈藍或藍綠色的菌落，來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數。所以為便于計數，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落。

三．在實際中的應用探討

1．檢測方法對樣品的適用性 

⑴.多管發酵法由于只需要根據水樣的取樣量來決定將樣品培養于何種培養液中（單倍或是三倍乳糖）進行培養，因此理論上可適用于各種水樣，但由于受發酵管容積的限制，其更適合檢測水源水、地表水和污染源廢水（取樣量不大），而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時，還需用公式進行換算。

⑵.濾膜法主要是采用抽濾裝置將細菌截留在濾膜上，然后將濾膜貼附在固體培養基上培養，因此可用于檢測體積較大的水樣，但受濾膜孔徑的限制，在檢測混濁度高（污染源廢水）、非大腸桿菌類細菌密度大（河湖水）的水樣時，對菌落計數統計有一定影響，此外，如水樣中有毒性物質較高，也會在濾膜上形成累積，抑制細菌培養。

2．檢測時間及操作過程的繁瑣度

⑴.多管發酵法需要經過初發酵試驗和復發酵試驗兩個過程后才能根據不同接種量的發酵管所出現陽性結果的數目，從MPN表中查得相應的MPN指數，從而zui后得出每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。可以看出，多管發酵法的培養時間至少需要2天以上，且對接種量、每一接種量的發酵管數都有嚴格要求（MPN表多采用9管、15管發酵管，接種量為10ml、1ml、0.1ml3種體積查詢），否則結果難以統計。

⑵.濾膜法目前主要采用成套NPS（濾膜+培養基+培養皿）進行細菌截留和培養，操作簡單，使用時只需用少量無菌水潤濕培養基墊即可使用，培養時間1天左右，能比多管發酵法更快地獲得結果，還具有高度的再現性和精密性。此外由于采用單片無菌包裝，節省了滅菌時間，還避免操作過程中的二次污染，并且長有菌落的濾膜片可在紫外線滅菌、干燥后作為檢測記錄*保存，更符合計量認證規范。

3．檢測成本的考慮

⑴.多管發酵法所用的發酵管、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗、高壓滅菌和紫外線消毒后重復使用，液態培養基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養基，檢測的成本不高。由于其方法較繁瑣，目前正有一種經過US EPA認證的水和廢水中糞大腸菌群檢測的標準方法逐步取代它，這種在美國、日本和加拿大等廣泛使用的檢測技術在國內也有一定使用（北京市環境檢測中心、北京市排水集團檢測中心等），這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來檢測水中糞大腸菌，雖然它是基于多管發酵法原理，不過卻將其操作大大簡化了。當然，伴隨著操作的簡化，檢測成本也大幅提高，設備基本上全是進口的，前期投入大概在8萬元至10萬元人民幣之間，且由于采樣瓶、試劑和密封計數盤都是一次性使用，單個樣品的檢測成本也將達到200元人民幣左右。

⑵.濾膜法主要采用的抽濾裝置（拋光不銹鋼3歧管過濾器、500ml漏斗、無油隔膜真空正壓兩用泵和手動無菌水加液器）也基本上來自于進口，目前很多單位使用的都是德國賽多利斯公司生產的產品，其前期投入大概在2萬元至3萬元人民幣左右（包括100套無菌包裝的NPS，12元/每套）。由于每個樣品需采用3種不同的稀釋比進行過濾培養，要使用3套NPS，所以單個樣品的檢測成本在50元人民幣左右。

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